Repository of Research and Investigative Information

Repository of Research and Investigative Information

Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences

مقایسه پروتئوم گونه های لیشمانیا ماژور حساس و مقاوم به درمان گلوکانتیم بر اساس پروتئومیکس

زارعان, مهدی (2015) مقایسه پروتئوم گونه های لیشمانیا ماژور حساس و مقاوم به درمان گلوکانتیم بر اساس پروتئومیکس. Doctoral thesis, دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز، اهواز، ایران Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran,School of Medicine دانشکده پزشکی

[img]
Preview
Text
m101731.pdf

Download (408kB) | Preview

Abstract

مقدمه: مگلومین آنتی مونیت (گلوکانتیم) مدتهاست که در ایران به عنوان بهترین انتخاب جهت درمان لیشمانیوز کاربرد دارد اما گزارشهایی مبنی بر مشاهده گونه های لیشمانیای مقاوم به این دارو در برخی از مناطق کشور وجود دارد. پروتئینها مهمترین نقش را در تنظیم پاسخهای سلولی بر عهده دارند بنابراین یافتن الگوی بیان پروتئین در گونه های حساس و مقاوم به دارو در دستیابی و درک مکانیسم های دخیل در پاسخ دارویی می توانند کمک کننده باشند. در این مطالعه از روشهای الکتروفورز دوبعدی و مس اسپکترومتری جهت تهیه نقشه پروتئینی و شناسایی و مقایسه پروتئینهای بیان شده و دخیل در ایجاد مقاومت لیشمانیا در بیماران حساس و مقاوم به درمان گلوکانتیم و از ایزوله های کلینیکی ساکن در یک منطقه جغرافیایی آندمیک استفاده شد. روش کار: پس از بررسی پاسخ به درمان گلوکانتیم بیماران از نظر بالینی، انگل های لیشمانیا از حاشیه زخم بیماران ساکن شهر شیراز و مبتلا به لیشمانیوز جلدی در محیط N.N.N جداسازی گردید. گونه ایزوله های جدا شده از بیماران پس از استخـراج DNA و استفــاده از دو روش Nested-PCR و ITS1-PCR-RFLP لیشمانیا ماژور تشخیص داده شد. حساسیت و مقاومت دارویی ایزوله حسـاس (Sh-214S) و ایـزولـه مـقـاوم (Sh-120R) به درمان گلوکانتیم توسط کشت درون سلولی آماستیگوتها در سلولهای j774A.1 و تعیین IC50 مورد ارزیابی قرار گرفت. پس ازکشت انبوه هر دو ایزوله در محیط RPMI 1640 استخراج توتال پروتئین آنها با استفاده از روش TCA/Acetone صورت گرفته و با روش برادفورد تعیین غلظت گردید. سپس با استفاده از ژل الکتروفورز دوبعدی پروتئینها بر اساس بار الکتریکی در بعد اول و بر اساس وزن مولکولی در بعد دوم تفکیک شده و پروفایل پروتئینی ایزوله ها مشخص و پس از رنگ آمیزی نیترات نقره آنالیز نقاط پروتئینی بر روی ژلها با استفاده از نرم افزاز Image Master 2D Melanie-6 صورت گرفت. پروتئینهای دارای اختلاف بیان پس از رنگ آمیزی کوماسی بلو از ژلها جدا سازی و جهت مس اسپکترومتری به روش MALDI-TOF-TOF به کشور انگلستان ارسال گردید. در نهایت با استفاده از پايگاه های اطلاعاتی و MASCOT پروتئين های مورد نظر شناسایی گردیدند. نتایج: با مشاهده باند bp560 در روش Nested-PCR و باندهای bp210 و bp140 حاصل از روش ITS1-PCR-RFLP گونه ایزوله های جداسازی شده لیشمانیا ماژور تشخیص داده شد. در تست مقاومت دارویی IC50 برای ایزوله حساس µg/ ml 3/1±12/5 و ایزوله مقاوم µg/ ml 7/3±6/25 بدست آمد. نتایج الکتروفورز دوبعدی پروفایل بیان پروتئینی متفاوتی را بین دو ایزوله حساس و مقاوم نشان داد. در حدود 2967 نقطه پروتئینی در ژلها شناسایی شد که پس از آنالیز 650 لکه پروتئینی 115 لکه پروتئینی در ایزوله های حساس و مقاوم دارای اختلاف بیان معنادار بودند (P<0.05). در ایزوله مقاوم از 89 لکه پروتئینی مورد اختلاف با ایزوله حساس، 60 پروتئین دارای افزایش بیان و 29 پروتئین دارای کاهش بیان بودند. بعلاوه 11 لکه پروتئینی در ایزوله مقاوم مشاهده شد که در ایزوله حساس دیده نشد. پروتئینهای شناسایی شده به روش MALDI-TOF-TOF بر اساس عملکرد بیولوژیکی خود در 14 گروه زیر دسته بندی شدند: Protein synthesis (6 پروتئین)، Cytoskeleton associated and cell motility (8 پروتئین)، Proteolysis (17 پروتئین)، Protein folding/chaperons stress response (5 پروتئین)، Fatty acid metabolism (1 پروتئین)، Electron transport respiratory chain (1 پروتئین)، Antioxidant/Detoxification (2 پروتئین)، Amino acid metabolism (1 پروتئین)، Carbohydrate metabolism (4 پروتئین)، Nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism (2 پروتئین)، RNA binding protein (1 پروتئین)،Signal transduction (1پروتئین)، Unknown biological process (1 پروتئین)، Hypothetical protein, Unknown function (2 پروتئین). نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که الکتروفورز دوبعدی و مس اسپکترومتری ابزار قدرتمندی جهت یافتن و شناسایی پروتئینهای دخیل در مقاومت دارویی لیشمانیا می باشند. همچنین مقاومت در ایزوله های بالینی به بیان پروتئین مختلف وابسته بوده و تغییرات ایجاد شده در بیان طیف وسیعی از پروتئینها سبب افزایش مقاومت و بقای انگل در شرایط نامساعد دارو می گردد و می توان پس از تایید نتایج مطالعات پروتئومیکس، با استفاده از راههایی نظیر انتقال ژن و یا خاموش سازی ژنهای فعال این پروتئینها پروژه های تحقیقاتی کاربردی ارزنده ای را در این زمینه انجام داد. Introduction: Meglumine antimoniate (Glucantime®) can be considered as the best option for the treatment of Leishmania parasite in Iran, but the prevalence of the parasite resistant to this drug is on the rise. Proteins have an important role in the regulation of cellular responses and finding expression protein maps in sensitive and resistant Leishmania parasites could be very useful in knowing the mechanisms of responses to drugs. In this study, two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and mass spectrometry methods were applied to determine and compare the protein spots expressed in the two field isolates of L. major and recovered from the patients who were clinically sensitive and resistant to Glucantime® treatment in the same region. Materials and methods: Leishmania parasites were isolated from the cutaneous lesions of ZCL infected patients in Shiraz, south of Iran. The species of the isolates were identified as L. major using Nested-PCR and ITS1-PCR-RFLP, after the DNA extraction. Sensitivity (Sh-214S) and resistance (Sh-120R) of the two isolates to meglumine antimonite were checked by the standard In vitro assays in the J774A.1 monocyte-macrophage mouse cell-line. Both sensitive and resistant L. major isolates were harvested in RPMI 1640 medium. The total Proteins extracted by using the TCA/Acetone method and proteins concentration were determined by Bradford assay. The protein spots were separated base on two charge and molecular weight by using a two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The gels were stained with silver nitrate and analyzed by Image Master 2D Melanie-6 software. Spots differently expressed between Glucantime® sensitive and resistant L. major isolates detected and were stained with coomassie blue then excised from the gels and send to England for identification and determination of their sequence by mass spectrometry (MALDI-TOF-TOF).finally by using the data base and MASCOT for identification specific proteins of resistant Leishmania to the Glucantime®. Results: The species of two sensitive and resistant parasites were isolated from ZCL patients were genetically confirmed as L.major by using Nested-PCR (560 bp) and ITS1-PCR-RFLP (210 bp and 140 bp). The results of drug sensitivity showed that IC50 values of Sb V were 5.12±1/3 µg/ ml and 25.6±3/7 µg/ ml in sensitive and resistant isolates respectively. 2DE results revealed differential protein expressions profile between resistance and sensitive isolates. About 2967 protein spots were detected. 650 protein spots visually noticeable by Melanie- 6 software analysis were done while 115 protein spots displayed significant changes under drug resistance (P<0.05). 89 protein spots represented considerable changes of expression in the resistant isolate of L. major compared to the sensitive isolate. Of these, 60 and 29 protein spots were up-and down-regulated, respectively. In addition, 11 protein spots present in the resistant isolate were noticed to be absent in the sensitive isolate. After identification by MALDI-TOF-TOF, proteins were classified on biological function and were divided in 14 groups as follows: Protein synthesis (6 proteins), Cytoskeleton associated and Cell Motility (8 proteins), Proteolysis (17 proteins), Protein folding/chaperons Stress response (5 proteins), Fatty acid metabolism (1 proteins), Electron transport respiratory chain (1 proteins), Antioxidant/Detoxification (2 proteins), Amino acid metabolism (1 proteins), Carbohydrate metabolism (4 proteins), Nucleoside, nucleotide and nucleic acid metabolism (2 proteins), RNA binding protein (1 proteins), Signal transduction (1 proteins), Unknown biological process (2 proteins), Hypothetical protein, unknown function (2 proteins). Conclusions: The results of this study indicated that 2-DE and mass spectrometry are strong tools to prove protein expression profiles between the two species of resistant and sensitive Leishmania major isolates. In addition, distinct biomolecules might be involved in antimony resistance in Leishmania major field isolates and remarkably a subset of proteins differentially expressed to enhance parasite survival in antimonial exposure. Identification of biological proteins functions related to the resistance mechanism requires further studies involving other technical methods like gene transmission and gene silencing.

Item Type: Thesis (Doctoral)
Keywords: لیشمانیا ماژور، مقاومت، حساسیت، ترکیبات پنج ظرفیتی آنتی موان (گلوکانتیم)، ژل الکتروفورز دوبعدی، MALDI-TOF-TOF، مس اسپکترومتری، نقشه پروتئینی Leishmania major, Resistant, Sensitive, Meglumine antimoniate (Glucantime®), 2- Dimensional gel electrophoresis, Mass spectrometry, MALDI-TOF-TOF, Proteome map
Subjects: Q Science > QR Microbiology
Divisions: Faculty of Medicine, Health and Life Sciences > School of Medicine
Depositing User: آقای بهرام سوسنی غریب وند
Date Deposited: 23 Aug 2017 07:10
Last Modified: 12 Aug 2018 03:35
URI: http://eprints.ajums.ac.ir/id/eprint/10461

Actions (login required)

View Item View Item