Repository of Research and Investigative Information

Repository of Research and Investigative Information

Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences

شناسایی و تعیین هویت گونه های عامل لیشمانیوز جلدی به روش Nested – PCR در شهرستان مهران

قـاسـمی, عـزت اله (2014) شناسایی و تعیین هویت گونه های عامل لیشمانیوز جلدی به روش Nested – PCR در شهرستان مهران. Masters thesis, دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز، اهواز، ایران Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences, Ahvaz, Iran,School of Medicine دانشکده پزشکی

[img]
Preview
Text
m101588.pdf

Download (1MB) | Preview

Abstract

مقدمه و هدف: لیشمانیوز جلدی یکی از مهم ترین بیماری های انگلی دنیا بوده که در دهه های اخیر بدلیل پیچیدگی های اپیدمیولوژیک در حلقه انتقال، به عنوان یکی از برجسته ترین معضلات بهداشتی بخصوص در کشورهای در حال توسعه معرفی شده است. بدلیل بروز بالای بیماری در سال های اخیر در شهرستان مهران و با توجه به هم مرز بودن این شهرستان با کشور عراق و متعاقب آن احتمال ورود سویه های متفاوتی از انگل لیشمانیا که می تواند دارای رفتارهای متنوعی از نقطه نظر شکل، دوره و درمان زخم باشد، این مطالعه با هدف شناسایی و تعیین هویت گونه های عامل لیشمانیوز جلدی و به منظور ارایه راهکارهای کنترلی و بهداشتی تلفیقی انجام گرفته است. مواد و روش ها: این مطالعه توصیفی مقطعی طی سال های 92-1391 بر روی لام های رنگ آمیزی شده مربوط به زخم 92 ایزوله انسانی مشکوک به سالک در شهرستان مهران انجام شد. پس از استخراج DNA ژنومیک انگل از سطح لام به کمک کیت استخراج DNA از خون و بافت شرکت تکاپو زیست "DynaBIOTM Blood/Tissue DNA Extraction Mini Kit ، با استفاده از پرایمرهای CSB2XF و CSB1XR ، ناحیه minicircle KDNA انگل لیشمانیا تکثیر یافت. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی 13Z و LIR و با استفاده از تکنیک Nested PCR گونه انگل تشخیص داده شد. پس از الکتروفورز محصولات بدست آمده و بر اساس حرکت باندهای ایجاد شده توسط هر نمونه در مقایسه با نمونه های استاندارد، گونه انگل تعیین گردید. . طول این قطعه تکثیر شده برای انگل های L.infantum و L.donovani، 680 bp، برای انگل L.tropica طول باند 750 bp و جهت انگل L.major طول باند این قطعه تکثیر شده 560 bp تعیین شد. سپس به منظور تأیید نتایج حاصل از Nested PCR، تعداد 10 نمونه از محصولات مثبت مرحله دوم PCRبه منظور بررسی میزان تشابه و اختلاف توالی های نوکلئوتیدی بدست آمده با توالی های ثبت شده در بانک ژن، تعیین توالی گردید. نتایج: در این مطالعه، وجود جسم لیشمن در 92 ایزوله با مشاهدات میکروسکوپی، روئیت گردید. تمامی نمونه ها، مورد آزمایش واکنش زنجیره ای پلیمرازی قرار گرفتند. پس از الکتروفورز محصولات حاصل از Nested PCR و مقایسه الگوی باندهای ایجاد شده با نمونه استاندارد، مشخص شد که 92 ایزوله انسانی مورد مطالعه دارای باند bp560 بوده و وجود L.major مسجل شد. 10 ایزوله تعیین توالی شده در بانک ژن تأیید و با شناسه KM555286-95 ثبت شدند. از سوی دیگر نتایج حاصل از تعیین توالی نشان داد توالی نوکلئوتیدی ایزوله های شماره 1، 2، 4، 5، 6، 7، 8 و 9 دارای 100% همولوژی با سویه AB678349.1)Leishmania major kinetoplast DNA (IranJWmaj)) می باشد. بر اساس مطالعه فوق، توالی نوکلئوتیدی ایزوله های شماره 3 و 10 کاملاً به هم شبیه بوده و با سویه MHOM/IL/67/LV561(AF308685.1) 99 درصد همولوژی دارد. نتیجه گیری: تکنیک Nested PCR یک روش مؤثر با حساسیت و اختصاصیت بالا جهت تعیین گونه انگل لیشمانیا در لام های رنگ آمیزی شده انسانی با گیمسا می باشد. همچنین این تکنیک نشان داد عامل اتیولوژیک بیماری سالک در شهرستان مهران، لیشمانیا ماژور و بیماری از نوع روستایی بوده و آلودگی %100 ایزوله های مورد مطالعه به انگل لیشمانیا ماژور، نشان از حضور ناقل، مخزن و ارتباط قطعی بین عوامل چرخه انتقال بیماری در این شهرستان دارد. همچنین در نتیجه انجام تعیین توالی، وجود پلی مورفیسم در ایزوله های ارسالی به اثبات نرسید و بررسی ژنتیکی بر روی ناحیه Mini-circle KDNA انگل لیشمانیا ماژور، حاکی از عدم رخ دادن موتان در ژن لیشمانیای این منطقه می باشد. از سویی نتایج تعیین توالی نوکلئوتیدی 10 ایزوله بررسی شده، نتایج حاصل از Nested PCR را تأیید نموده و ایزوله های مربوطه لیشمانیا ماژور تشخیص داده شدند. Results: In this study, Leishman bodies with microscopic observations, were seen in 92 isolates. All samples were tested for the polymerase chain reaction (PCR). After electrophoresis of Nested PCR products and comparison of the banding pattern that generated by the standard model, it was found that 92 human isolates that studied, have 560bp, and presence of L.major was determined. 10 sequenced isolates, were confirmed in gene bank and recorded with KM555286-95 address. The results of sequencing showed that the nucleotide sequence of 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 and 9 isolated numbers, have 100% homology with (AB678349.1)Leishmania majorkinetoplast DNA (IranJWmaj) strain. Based on the above study, the nucleotide sequence of 3 and 10 isolated numbers, are quite similar and they have 99% homology with (AF308685.1)MHOM/IL/67/LV561 strain. Conclusion: Nested PCR technique is an effective method with high sensitivity and specificity for detection of Leishmania species in stained smears with Giemsa from human. Also, this technique showed the etiologic agent of cutaneous leishmaniasis in the city of Mehran, was Leishmania major, and disease was kind of rural and 100% of Leishmania major infection isolates, indicating the presence of carriers, reservoir and definite relationship between disease transmission cycle in this city. Also due to the result of sequencing, the polymorphism in isolates were not proved and genetic study on the Mini-circle KDNA region from Leishmania major, showed no occurrence of mutants in Leishmania gene in this region. On the other hand,, the results of nucleotide sequencing of 10 reviewed isolates, confirmed the results of Nested PCR and the isolates were identified as Leishmania major. Introduction and aim: Cutaneous leishmaniasis is one of the most important parasitic diseases in the world that in recent decades, due to the complexity of the epidemiological transition cycle, is presented as one of the leading health problems, especially in developing countries. Because of its high prevalence in recent years in the city of Mehran and due to the nature of the city bordered by Iraq and subsequently, the possibility of entrance divergent strains of Leishmania which can have different behaviors in terms of shape, course and treatment of the wound, this study have been conducted to aimed to detect and identify species that cause cutaneous leishmaniasis, and to provide integrated solutions to control and health. Material and methods: This cross-sectional study is done from 2013-2014 on 92 stained slides of human isolates suspicious cutaneous lesions in the city of Mehran. After extraction of Parasite genomic DNA from blood smears with help of blood and tissue DNA extraction kit of Takapouzist Company, "DynaBIOTM Blood/Tissue DNA Extraction Mini Kit, using primers CSB2XF and CSB1XR, the Leishmania minicircle KDNA was amplification. Then species of parasite were detected with using specific primers 13Z and LIR and Nested PCR technique. After electrophoresis of the obtained products and by moving bands generated by each sample in compared with standard samples, the species of parasite was obtained. Amplified fragment length for L.infantum and L.donovani parasites, 680 bp, for L.tropica, 750 bp and for L.major, 560 bp was determined. In order to confirm the results of Nested PCR, 10 positive samples from the second round of PCR products, in order to assess the similarities and differences in obtained nucleotide sequences with sequences registered in the Gene Bank, was sequenced.

Item Type: Thesis (Masters)
Keywords: لیشمانیوز جلدی، Nested PCR، Sequencing، لیشمانیا، ایران، مهران Cutaneous Lishmaniosis, Nested PCR, Sequencing, Lishmania, IRAN, Mehran
Subjects: Q Science > QR Microbiology
Divisions: Faculty of Medicine, Health and Life Sciences > School of Medicine
Depositing User: آقای بهرام سوسنی غریب وند
Date Deposited: 23 Aug 2017 08:42
Last Modified: 23 Aug 2017 08:42
URI: http://eprints.ajums.ac.ir/id/eprint/10474

Actions (login required)

View Item View Item