Repository of Research and Investigative Information

Repository of Research and Investigative Information

Ahvaz Jundishapur University of Medical Sciences

بررسی ژن همولیزین "aspHS" و فنوتایپ آن در ایزوله های مختلف آسپرژیلوس فومیگاتوس Study of hemolysin gene " aspHS" and its phenotype in Aspergillus fumigatus isolates

گنج, فرزانه (2016) بررسی ژن همولیزین "aspHS" و فنوتایپ آن در ایزوله های مختلف آسپرژیلوس فومیگاتوس Study of hemolysin gene " aspHS" and its phenotype in Aspergillus fumigatus isolates. Masters thesis, دانشگاه علوم پزشکی جندی شاپور اهواز,دانشکده پزشکی

[img]
Preview
Text
m120982.pdf.pdf

Download (853kB) | Preview

Abstract

مقدمه؛ آسپرژیلوس فومیگاتوس پاتوژن ترین گونه در بین سایرگونه های آسپرژیلوس می باشد، که بیش از 90 درصد موارد کشنده بیماری مربوط به آن است. علت آن وجود فاکتورهای بیماری زایی است، که تولید آنها وابسته به حضور ژن های خاص می باشد. یکی از این فاکتورهای بیماری زا تولید آنزیم همولیزین می باشد که توسط ژن asp-HS کد می شود. -ASP همولیزین، قارچ را قادر می سازد تا سلولهای خونی را تخریب کند و اثرات سایتوتوکسیک روی ماکروفاژها و سلولهای اندوتلیال دارد در نتیجه فاکتور همولیزین بیماری را توسعه می دهد. شناسایی در حد گونه و تنها بر اساس مورفولوژی مشکل ساز است و اشتباهاتی را به همراه خواهد داشت. روش هاي مولکولار بیولوژی با سرعت و دقت بالاتر قادر به افتراق بين گونه هاي نزديک به هم می باشند و همچنین شناسايي ژنوتايپ ها و پلئومورف ها را آسان تر مي سازند. تحقیقات آزمایشگاهی نشان داده است که الگوی تولید همولیزین در همه ایزوله های آسپرژیلوس فومیگاتوس به یک صورت نمی باشد، بنابراین هدف از این مطالعه، بررسی فنوتایپی فعالیت آنزیم همولیزین در ایزوله های مختلف آسپرژیلوس فومیگاتوس و استفاده از تکنیک PCR-RFLP در شناسایی تفاوت هایی است که در ناحیه ژنی aspHS این ایزوله ها وجود دارد. مواد و روش ها؛ برای این مطالعه پنجاه و سه ايزوله آسپرژيلوس فومیگاتوس شامل 4 ايزوله استاندارد، 10 ايزوله باليني و 39 ايزوله محيطي جمع آوري شد که همگی از نظر مورفولوژي تاييد گرديدند. به دلیل وضوح بالای همولیز در آسپرژیلوس نایجر، از 10 ایزوله آسپرژیلوس نایجر نیز برای مقایسه کار استفاده گردید. جهت سنجش فعالیت همولیتیک، ایزوله ها در محیط بلاداگار در دمای°C 37 به مدت 48ساعت انکوبه شدند. تشخیص مولکولی با تکنیک PCR-RFLP توسط دو پرایمر F-Asphs ، R-Asphs برای بدست آوردن باند bp180 و دو پرایمرAfhem1 ، Afhem2 برای بدست آوردن باند bp 450 انجام گرفت. در ادامه کار آنزیم های محدودکننده NcoI و TaqI جهت شناسایی ژنوتایپ های مختلف مورد استفاده قرار گرفتند و پرایمرهای AnoF و AnoR که از روی ژن همولیزین آسپرژیلوس نایجر طراحی شده بود، جهت شناسایی وسعت بیشتری از ژن همولیزین در آسپرژیلوس فومیگاتوس مورد استفاده قرار گرفت. نتایج؛ سنجش فنوتایپی فعالیت آنزیم همولیزین در آسپرژیلوس فومیگاتوس و آسپرژیلوس نایجر نشان داد، تمامی ایزوله های مطالعه شده قادر به ایجاد هاله همولیز با شدت متغیر(دامنه 6 تا 6/7) در اطراف کلنی های محیط بلادآگار می باشند. در PCR از ناحیه همولیزین توسط جفت پرایمر F-Asphs و R-Asphsیک باند bp180 و توسط پرایمرهای Afhem1 و Afhem2 یک باندbp 450 برای تمام ایزوله ها بدست آمد. سکانس محصولات PCR بدست آمده 99 درصد با ژن همولیزین در data base مشابهت داشتند. بعد از هضم محصولات PCR با آنزیم های محدود کننده NcoI و TaqI به طور جداگانه، بیش از 97 درصد مشابهت، دیده شد و فقط 3 درصد پلئومورف بدست آمد. با استفاده از ژن همولیزین در آسپرژیلوس نایجر و پرایمرهای سکانس بیشتر از ژن همولیزین، از پرایمرهای AnoF وAnoR باندی به طول bp1200 برای آسپرژیلوس فومیگاتوس بدست آمد. نتیجه سکانس این باند فقط مشابه باند bp450 بدست آمده قبلی بود. نتیجه گیری؛ این مطالعه نشان داد هر چند که پلئومورف در ژن همولیزین کم دیده شد ولی ژن همولیزین یک ژن مناسب به عنوان ژنتیک مارکر در آسپرژیلوس فومیگاتوس می تواند استفاده گردد. INTRODUCTION: Aspergillus fumigatus (A.fumigatus) is the most pathogenic of all aspergilli fungi, with more than 90 percent of mortality rates of diseases. The major cause of this virulence is pathogenic factors dependent on specific gene sequences. Such a factor is the release of haemolysin which is encoded by aspHS gene. Haemolysin helps fungi to kill blood cells and has cytotoxic effects on endothelial cells and macrophages. Diagnosis merely based on morphological properties provides difficulties and is prone to uncertainties. Molecular biological methods with higher speed and precision are however able to differentiate morphologically identical genus, and help with detection of genotypes and polymorphs. In vitro studies indicate that the path of haemolysin release is different in diverse A. fumigatus isolates. The present study provides a phenotypic examination of haemolysin enzyme in these isolates through real-time PCR-RRLP to detect differences in aspHS gene sequence. MATERIALS AND METHODS: Fifty three A. fumigatus isolates including 4 standard isolate, 10 clinical, and 39 environmental isolates were approved morphologically for study. Due to higher resolution in haemolytic activity in A. fumigatus, 10 A. niger isolates were selected as control group. To measure haemolytic activity, isolates were incubated in blood agar medium at 37 °C for 48h. F-Asphs and R-Asphs primers in PCR was ableto obtatina 180bp band and Afhem2 and Afhem1 primers recovery a 450bp band. Restriction enzymes NcoI and TaqI also were able to identification of different genotypes. AnoR and AnoF primers, redesigned according to A. nigerhaemolysin sequences, provided was able to identification of wider sequences in A. fumigatus haemolysin. RESULTS: A phenotypic comparison of haemolysin activity in A. fumigates and A.niger indicated that all isolates were able to create haemolytic cover with varying degrees (6 to 7.6) around blood agar colonies. PCR products from sequence were strikingly similar (99 percent) to haemolysin in data base. After digestion of PCR products by restriction enzymes NcoI and TaqI, a similarity of 97 percent also was shown, with only 3 percent polymorphism. Using haemolysin sequences in A. niger and its primers, and AnoF and AnoR primers, a band were detected for A. fumigatus 1200bp long. An outcome of priming of this sequence was only similar to that of 450bp band. CONCLUSION: The present study indicated that despite little polymorphism in haemolysin gene, it is still a proper sequence for genetic marking of A. fumigatus.

Item Type: Thesis (Masters)
Keywords: آسپرژیلوس فومیگاتوس، PCR-RFLP ، ژن aspHS Aspergillus fumigatus, RCR-RFLP, aspHS
Subjects: Q Science > QR Microbiology
Q Science > QR Microbiology > QR180 Immunology
Divisions: Faculty of Medicine, Health and Life Sciences > School of Medicine
Depositing User: آقای بهرام سوسنی غریب وند
Date Deposited: 16 Mar 2017 11:27
Last Modified: 16 Mar 2017 11:27
URI: http://eprints.ajums.ac.ir/id/eprint/3312

Actions (login required)

View Item View Item